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07年第十届挑战杯学术科技类(4)

作者:dzxyswx 时间:2012-05-07 点击数:

 
188Re标记超顺磁性纳米凝胶的制备及其在生物靶向中的应用

 

摘要:应用光化学方法成功制备了聚丙烯酰胺包覆的磁性纳米凝胶,在聚丙烯酰胺-磁性纳米凝胶进行Hoffmann 降解,成功在凝胶表面引入—NH2活性基团,通过该活性基团进而对磁性纳米凝胶进行甲氧基聚乙二醇(MPEG),制得MPEG修饰超顺磁性纳米凝胶,从而使超顺磁性纳米凝胶具有良好的亲水性和生物相容性。以戊二醛为交联剂,在MPEG-超顺磁性纳米凝胶表面偶联L-组氨酸,并进一步标记188Re。经左耳静脉注入大兔体内,以观测其在体内的组织分布及磁靶向效应,结果显示MPEG-超顺磁性纳米凝胶在体内主要分布在肺、脾、心脏及肝脏等器官,可部分透过“血脑屏障”,对外置磁场具有良好磁靶向性,是一种良好的药物靶向载体。

关键词:超顺磁性纳米凝胶;生物靶向;MPEG, 188Re

 

1、引言

 

超顺磁性纳米凝胶(superparamagnetic nanogels)由于其特殊的磁学性质及极低的体内毒性,已引起人们的广泛关注[1],纳米凝胶表面可被蛋白质或其它亲水聚合物等具有生物降解性或生物相容性的物质修饰,从而广泛应用于固定化酶[2,3]、生物拆分[4-6]、免疫检测[7-8]、生物传感器[9]、磁共振成像(MRI)[10]等生物医学领域,近来,超顺磁性纳米凝胶作为靶向药物载体的研究越来越引起人们的重视[11-13]。

磁性纳米凝胶由Fe3O4核和交联的壳层水凝胶组成,属于磁性纳米微球的一种。壳层的水凝胶对Fe3O4的包覆避免了Fe3O4纳米粒子的氧化和团聚,加之其水凝胶的壳层具有更好的亲水性和生物相容性,从而使磁性纳米凝胶成为生物领域理想的药物载体。

磁性纳米凝胶的制备方法很多,如微乳液聚合、乳液聚合、原位还原等[14,15],但这些方法在制备过程中都要引入引发剂、乳化剂等有机溶剂,严重限制了其在生物体内的应用,且这些方法所制备的磁性纳米凝胶粒径分布宽,难以考查不同粒径在体内的作用方式。本实验中,采用光化学方法在水溶液中制备磁性纳米凝胶,该方法无需加入引发剂,而且由于光化学本身的特点我们制备的磁性纳米凝胶粒径分布窄,且在一定范围内粒径可控,所有这些为其生物应用奠定了良好的基础。我们首先以丙烯酰胺为单体、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂在无引发剂和乳化剂条件下通过绿色友好的紫外线再线辐照技术制备了在25-180nm范围内粒径可控的聚丙烯酰胺包覆的超顺磁性纳米凝胶,对磁性纳米凝胶进行Hoffmann降解得到表面带有伯胺基的磁性纳米凝胶,进而在磁性纳米凝胶表面进行MPEG修饰,制备得到MPEG-超顺磁性纳米凝胶,并对其进行表征。以戊二醛为交联剂,在超顺磁性纳米凝胶表面偶联L-组氨酸,并共价偶联放射性188Re化合物,以观测MPEG-超顺磁性纳米凝胶在体内的组织分布及磁靶向效应。

 

2、实验部分

 

  2.1 材料

 

单体丙烯酰胺(Acrylamide,AM), 交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺[N,N’-Mehhylene-bis-(acrylamide),MBA],购自中国医药(集团)上海试剂公司;NaOH 和NaClO购自上海恒信试剂公司;500W氙灯作为紫外光源。纯度为99.99%的N2作为保护性气体。使用上海试剂四厂昆山分厂浓度为38% HCl 和三次重蒸水配制1mol dm-3HCl溶液;丙烯酰胺使用前通过重结晶进行纯化,其他试剂直接进行使用;所有化学试剂均为分析纯,所有溶剂由三蒸水配制。

3000HS型光子相关光谱(PCS )用于纳米粒子的粒径测定;Nicolet FTIR 光谱用于磁性纳米凝胶表面官能团的测定; 

 

2.2 聚丙烯酰胺磁性纳米凝胶的制备

 

   应用部分还原法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子,反应式如下:

 



 
  



6Fe3+ + SO32- +18NH4OH               2Fe3O4 +SO42- +18NH4+ + 9H2O 

 

控制反应条件,可制得粒径为10 nm Fe3O4纳米粒子。

    以丙烯酰胺为单体,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,N2在整个反应过程中作为保护气在带有搅拌器的100 ml 三颈石英瓶中通过紫外线在线辐照10 小时制得聚丙烯酰胺包覆的磁性纳米凝胶,在外界磁场作用下用三蒸水洗涤三次最后超声分散。该磁性纳米凝胶可在多分散系数低于0.2壳层厚度在15到170 nm范围内通过改变单体浓度、辐照剂量、反应时间温度和搅拌速度进行调控。聚丙烯酰胺包覆的磁性纳米凝胶在1M HCl 溶液中浸泡 12小时不被腐蚀且储存三个月仍保持稳定性。

 

2.3 MPEG修饰超顺磁性纳米凝胶

 

为表面结合188Re化合物及其它生物分子,首先需要将聚丙烯酰胺包覆的磁性纳米凝胶表面的羰基进行Hoffmann 降解消除[16]。将前面制备纯化的聚丙烯酰胺包覆磁性纳米凝胶置于烧瓶中,将25 ml NaClO和 50 ml 2.4wt%的混合物分三批加入到烧瓶中,以 200r/min的转速搅拌下进行Hoffmann降解30min。

向含150mL甲苯的三颈瓶中加入100g MPEG-500,再逆流逐滴加入适量的(16mL)嘧啶及亚硫酰二氯(43.3mL)(MPEG-500:嘧啶:亚硫酰氯 = 1:1:3)。混合液加热4h,最后冷却至室温,过滤除去嘧啶,样品真空除去甲苯,便可制得便CH3(OCH2CH2)nOCl,反应式如下:


C5H5N+CH3(OCH2CH2)nOH+SOCl2      C5H5NH+Cl- + CH3(OCH2CH2)nOCl
 
  

 



制备的CH3(OCH2CH2)nOCl与聚丙烯酰胺-磁性凝胶混合,调pH为11,混合液在室温孵育12h,磁性分离,反复清洗,即可制得MPEG-超顺磁性纳米凝胶。

 

2.4 188Re标记超顺磁性纳米凝胶的制备

 

戊二醛作为交联剂,在含伯胺基MPEG-超顺磁性纳米凝胶表面交联L-组氨酸,反应如图1。

 


Fig.1: Procedure of covalently linking L-histidine onto the MPEG-modified magnetic nanogels.

1mL 含伯氨基MPEG-超顺磁性纳米凝胶 (约10 mg) 用 0.1M 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH 7.4) 清洗一次,加入1mL戊二醛(2.5 wt%,溶于PBS中),超声混匀, 于4 ℃ 孵育4 h.。反应完毕,磁性分离,并用PBS反复清洗以除去未反应的戊二醛。再将磁性纳米凝胶重新溶于0.2 mol/L L-组氨酸(新鲜配制,0.1 mol/L PBS-0.15 mol/L NaCl-0.005 mol/L EDTA, pH 7.2)中, 室温孵育12h,磁性分离,用硼酸盐缓冲液(pH 9.2)清洗。重新分散于含0.5mg/ml NaBH4的硼酸盐缓冲液中,4℃孵育30min,以除去未反应的醛基。最后,磁性纳米凝胶用PBS清洗,并保存于0.1 mol/L MES (pH 6.6)中。

按文献17的方法制备188Re标记磁性纳米凝胶:将5.3 mg BH3.NH3置于10mL玻璃瓶中,通过CO气体20min。将12mL H3PO4 (85 wt%)与1 mL 188Re高铼酸盐及超顺磁性纳米凝胶混合,取1mL混合液加入玻璃瓶中,70℃水浴15min。TLC来计算敖合效率,用一个SiL G/F254玻璃杯作固定相,100% 的乙腈作为流动相。Rf ([188Re(CO)3(H2O)3]+)为0.1-0.2,Rf (188ReO2)为 0,Rf (自由188Re高铼酸盐)为0.8-1。

制得由100μL [188Re(CO)3(H2O)3]+和100 μL偶联L-组氨酸的MPEG-超顺磁性纳米凝胶(分散于0.5M的MES中)组成的混合液,在70 ℃孵育40min,磁性分离出188Re标记超顺磁性纳米凝胶。通过γ-计数来计算188Re标记超顺磁性纳米凝胶的放射能,188Re标记率按下公式计算:

标记率(%)= (1- 上清液中的放射强度/总放射强度)×100%

2.5 188Re标记超顺磁性纳米凝胶的体内稳定性研究

 

取10mg 188Re标记超磁性纳米凝胶于1mL小牛血清中混合,37℃孵育,分别处理1、4、8、18、24h后观测其稳定性。

 

2.6 188Re标记超顺磁性纳米凝胶在体内的靶向效果 

 

5只大兔随意分成两组,对照组的3只和实验组的2只。麻痹之后,由左耳静脉注射188R标记超顺磁性纳米凝胶3.7×106 Bq(溶于PBS中,pH7.4),110min后,解剖对照组大兔,测定其脾、肾、肺、胃、脑、血液、心脏以及肌肉内的放射能。

静脉注射后,在实验组大兔右后腿固定外磁场(磁场强度0.5 T),应用γ-计数器活体监测大兔后腿在不同时间点(30, 40, 50, 70, 90, 110 min)的放射能,比较大兔左右后腿的放射能的区别,以计算188R标记超顺磁性纳米凝胶在体内的磁靶向效果。

 

3、结果与讨论

 

3.1 MPEG-超顺磁性纳米凝胶的制备及表征

 

通过部分还原方法和随后的水热过程合成了高结晶度和较好磁性的Fe3O4纳米粒子[18,19],应用光化学方法可制得聚丙烯酰胺磁性纳米凝胶,对其进行Hoffmann降解,可获得表面带有伯氨基的聚丙烯酰胺磁性纳米凝胶,通过-NH2基团可将MPEG修饰在磁性纳米凝胶表面,应用PCS,FTIR对MPEG-超顺磁性纳米凝胶进行表征,结果MPEG成功偶联在了磁性纳米凝胶表面,其平均粒径为44.3nm。

1643 cm-1 和582 cm-1 分别是N-H(–NH2 )和Fe-O(Fe3O4,)的伸缩振动峰,1369 cm-1 和1022 cm-1 分别是C-H(–CH3) 和C–O–C(-O(OCH2CH2)nCH3)的伸缩振动峰。 FTIR 结果说带-NH2的聚丙烯酰胺磁性纳米凝胶表面包覆了MPEG,由于1369 cm-1处的吸收极弱,说明MPEG-超顺磁性纳米凝胶中含有极少量的–CH3。

 


Fig.3: FTIR spectrum of MPEG-modified magnetic nanogels. 
 
Fig. 2:Particle sizes of MPEG-modified superparamagnetic nanogels measured by PCS. The concentration was 10-5 mol/L. 
 
良好的稳定性是药物靶向载体在体内应用的必要条件,188Re 的标记效率为 95±0.5%。188Re标记超顺磁性纳米凝胶在小牛血清中的稳定性如图4所示:

88Re标记超顺磁性纳米凝胶在小牛血清中孵育24h后仍可保持98%以上的放射能,只损失不足2%,说明188Re标记超顺磁性纳米凝胶可在体内保持高度稳定。

188Re标记超顺磁性纳米凝胶在正常大兔体内的组织分布如图5所示,。

Fig.5: Average radioactivity distribution of 188Re-labeled MPEG-modified superparamagnetic nanogels in organs in control group (3 rabbits, without external magnetic field,110 min later after the 188Re-labeled MPEG-modified superparamagnetic nanogels were intravenously injected into left ears).

 由图中可以看出,对照组大兔经左耳静脉注射后,188Re标记超顺磁性纳米凝胶主要分布在肺、脾、心脏及肝脏等器官,有少量的右手腿部位也有少量的超顺磁性纳米凝胶,由于超顺磁性纳米凝胶可被肺脏中毛细血管所捕获,因此,超顺磁性纳米凝胶在肺脏中的分布较其它器官非富地多。另外,血液中的放射能也远比心脏、脑部、胃部及肌肉中非富得多,这再一次证明188Re标记超顺磁性纳米凝胶在体内可长期保持很高的稳定性,良好亲水性和生物相容性。同时,我们发现,有少量的磁性纳米凝胶进入脑部,这说明超顺磁性纳米凝胶可以部分地透过“血脑屏障”,对于一些脑部肿瘤的治疗具有重大意义。

我们观测了实验组左右后腿部不同时间点的放射能(图6),由结果可以看出,在20-50min内,超顺磁性纳米凝胶在右后腿部(外置0.5T磁场,靶向部位)的分布略高于左后腿部,但无明显差别,在70-110min内,在右后腿部的分布约为左后腿部2部,且仍有增大的趋势。超顺磁性纳米凝胶在体内的高度稳定性、亲水性及生物相容性,使其具有较长的血药时间,有利于超顺磁性纳米凝胶在滞留在外磁场附近。

 

 

4、结论

 

应用光化学方法成功制备了MPEG-超磁性纳米凝胶,该超顺磁性纳米凝胶为核壳结构,平均粒径为44.3nm,粒径均一,具有高的分散性和稳定性。以戊二醛为交联剂,将L-组氨酸偶联到超顺磁性纳米凝胶表面,进而标记放射性物质188Re,以观测超顺磁性纳米凝胶在体内的组织分布及靶向效果。体内实验证明MPEG-超磁性纳米凝胶在体内主要分布在肺、脾、肝脏及肾脏等器官,可部分透过“血脑屏障”。MPEG-超磁性纳米凝胶在体内对外置磁场具有明显地靶向效应,是一种良好的靶向药物载体。

 

致谢

该项工作得到上海科委专项基金 (No.0352nm120) 和中科院上海应用物理研究所级创新课题(No.90120310)的资助。

 

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