从废菌丝体中提取壳聚糖的研究
李静 孙绪华 徐丹
生物系
 

摘  要：以废菌丝体为原料，通过对酸法、碱法、酸碱交替法脱蛋白工艺效果的比较，确定采用酸碱交替法脱蛋白工艺，对脱蛋白产物进行脱色，然后对脱乙酰基工艺进行了研究，结果确定50%氢氧化钠处理2.5h，固液比1∶15，温度110℃为最佳脱乙酰基条件。壳聚糖得率约为13%。所得壳聚糖产品性能指标优良，达到食品级壳聚糖的要求。
关键词：废菌丝体 壳聚糖 提取
 



地球上存在的天然有机化合物中，甲壳素在数量上仅次于纤维素，是地球上第二大可再生资源，也是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机物。它广泛存在于海洋节肢动物（如虾、蟹）的甲壳中及植物的细胞壁中。估计自然界每年生物合成的甲壳素将近100亿吨，是一种取之不尽、用之不竭的自然资源[1] 。1991年国际甲壳素大会将甲壳素和壳聚糖明确定为除糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质以外的第六大生命元素。
1.甲壳素和壳聚糖的结构甲壳素（chitin）又名几丁质、甲壳质和壳多糖等，其化学名称为（1，4）－2－乙酰氨基－2－脱氧－β－D－葡萄糖（poly－（1，4）－2－acetamino－2－deoxy－β－D－glucose），分子式为(C8H13NO5)n，是由N－乙酰－2－脱氧－D－葡萄糖以β－1，4糖苷键缩合而成的，是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖[2]。壳聚糖（chitosan）又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素和甲壳胺等。其化学名称为（1，4）－2－氨基－2－脱氧－β－D－葡萄糖（poly－（1，4）－2－amino－2－deoxy－β－D－glucose），分子式为(C6H11NO4)n，是甲壳素脱乙酰基的产物。一般而言，甲壳素的脱乙酰度达55%以上就可称之为壳聚糖。在自然界中，壳聚糖通常以甲壳素的形式存在。纤维素、甲壳素和壳聚糖的结构非常相似，不同之处是每个纤维素葡萄糖单元二号碳原子上的－OH基团相应地换成了－NHCOCH3或－NH2基团。纤维素、甲壳素和壳聚糖的结构式分别如图1.1

              　　　
指导教师：王传芬(1980-),生物系，工学硕士。　　　     　      作品获奖等次：校级竞赛三等奖
 
 

 

 

 



中(a)、(b)和(c)所示。
 


(a)纤维素的结构式
 


(b)甲壳素的结构式
 


(c)壳聚糖的结构式
 

图1 纤维素、甲壳素和壳聚糖的结构式[3－7]
Figure1  Constitutional formula of      cellulose, chitin and chitosan
 

 

2.壳聚糖提取工艺的研究2.1碱法脱蛋白工艺的研究脱蛋白工艺是提取工艺的第一步，蛋白质脱除是否完全对下面的实验影响相当显著。经过一些单因素实验，确定了对蛋白质脱除影响比较明显的三个因素，NaOH浓度，NaOH用量和反应时间，以这三个因素为考察细胞壁破碎程度的对象，每个因素取三个水平，以提取液中的蛋白质溶出物占菌丝体含量Y蛋白（%）为考察指标，进行正交实验，正交因素水平表如表1所示，正交实验结果如表2所示。
由表2可以看出，RB＞RC＞RA，各因素对Y蛋白的影响按从大到小顺序依次为B（固液比）＞C（时间）＞A（碱浓度），最佳方案为：A1 B3 C1，即浓度5%的NaOH，固液比1∶20，蒸馏1.5h。

 

表1  L9(33)正交实验因素水平表
Table1 Factors and level of orthogonal test L9(33)
   因素 
                  
水平 
 A 碱浓度    CNaOH（%）
 B 固液比 
（W/V）
 C 时间
（h）
 
1
 5
 1∶10
 1.5
 
2
 10
 1∶15
 2.0
 
3
 15
 1∶20
 2.5
 

 

2.2酸法脱蛋白工艺研究
在碱法脱蛋白实验的基础上，对酸法脱蛋白的工艺也进行了初步的研究，比较酸法与碱法的优劣。与碱法的影响因素相同，酸法也采用稀盐酸的浓度、固液比和处理时间为实验影响因素，每个因素取三个水平，以Y蛋白（%）为指标做正交实验，确定较优的工艺条件。正交因素水平表如表3所示，正交实验结果如表4所示。
由表4可以看出：RB＞RA＞RC，各因素对Y蛋白的影响按从大到小顺序依次为B（固液比）＞A（酸浓
度）＞C（时间），最佳方案为A3 B3 C2，即浓度4%HCl、固液比l∶20、处理时间2h。从实验结果看酸处理效果比碱处理效果稍差，因此碱法比酸法更具优势。
 

 

 

 

表2  L9(33)正交实验结果及极差分析表
Table2 Results and differential analysis of orthogonal test L9(33)
实验号
 A 碱浓度   CNaOH（%）
 B固液比（W/V）
 C 时间  （h）
 Y蛋白
（%）
 
1
 1
 1
 1
 1.82
 
2
 1
 2
 2
 1.78
 
3
 1
 3
 3
 2.28
 
4
 2
 1
 2
 1.28
 
5
 2
 2
 3
 1.58
 
6
 2
 3
 1
 1.87
 
7
 3
 1
 3
 1.32
 
8
 3
 2
 1
 2.18
 
9
 3
 3
 2
 1.61
 
K1
 5.88
 4.42
 5.87
  
 
K2
 4.72
 5.54
 4.67
 
K3
 5.11
 5.76
 5.18
 
k1
 1.96
 1.47
 1.96
 
k2
 1.57
 1.85
 1.56
 
k3
 1.70
 1.92
 1.73
 
R
 0.39
 0.45
 0.40
 
优方案
 A1
 B3
 C1
 
影响主次顺序
 B＞C＞A
 
      

 

表3  L9(33)正交实验因素水平表
Table3  Factors and level of orthogonal test L9(33)
   因素
 

水平 
 A 酸浓度    CHCl（%）
 B 固液比
 （W/V）
 C 时间
（h）
 
1
 2
 1∶10
 1.5
 
2
 3
 1∶15
 2.0
 
3
 4
 1∶20
 2.5
 

 

 

表4  L9(33)正交实验结果及极差分析表
Table4  Results and differential analysis of orthogonal test L9(33)
实验号
 A 酸浓度   CHCl（%）
 B固液比（W/V）
 C 时间  
（h）
 Y蛋白
（%）
 
1
 1（2）
 1（1∶10）
 1（1.5）
 0.75
 
2
 1
 2（1∶15）
 2（2.0）
 0.77
 
3
 1
 3（1∶20）
 3（2.5）
 1.03
 
4
 2（3）
 1
 2
 0.76
 
5
 2
 2
 3
 0.70
 
6
 2
 3
 1
 0.93
 
7
 3（4）
 1
 3
 0.94
 
8
 3
 2
 1
 0.97
 
9
 3
 3
 2
 1.18
 
K1
 2.55
 2.45
 2.65
  
 
K2
 2.39
 2.44
 2.71
 
K3
 3.09
 3.14
 2.67
 
k1
 0.85
 0.82
 0.88
 
k2
 0.80
 0.81
 0.90
 
k3
 1.03
 1.05
 0.89
 
R
 0.23
 0.24
 0.02
 
优方案
 A3
 B3
 C2
 
影响主次顺序
 B＞A＞C
 

 

2.3酸碱交替法脱蛋白工艺的研究从碱法和酸法破碎菌丝体细胞壁脱蛋白的效果看，酸法脱蛋白的效果比碱法略差，但菌丝体中除了蛋白质之外，还有非几丁质糖类、核酸、无机盐等杂质需要脱除，出于工业化生产的考虑，本文对经济、简便、易于工业化大生产的酸碱交替化学脱蛋白法也进行了研究。温度在100℃下，采用碱浓度、稀盐酸的浓度、处理时间、固液比和处理温度为实验影响因素，Y蛋白（%）为考查指标做正交实验，确定较优的工艺条件。实验方案如表5所示，正交实验结果如表6所示。
表5 L8(4×24) 正交实验因素水平表
Table5 Factors and level of orthogonal test L8(4×24)
因    素
 

水平
 A 碱浓度   CNaOH（%）
 B 酸浓度    CHCl（%）
 C 酸碱处理顺序
 D固液比 （W/V）
 E 时间      （h）
 
1
 5
 2
 先酸后碱
 1∶10
 45＋45
 
2
 10
 3
 先碱后酸
 1∶15
 60＋60
 
3
 15
  
 
4
 20
 

 

表6 L8(4×24)正交实验结果及极差分析表
Table6 Results and differential analysis of orthogonal test L8(4×24)
实验号
 A 碱浓度  CNaOH(%)
 B 酸浓度    CHCl(%)
 C 酸碱处理顺序
 D固液比 (W/V)
 E 时间      (h)
 Y蛋白(%)
 
1
 1
 1
 1
 1
 1
 1.98
 
2
 1
 2
 2
 2
 2
 2.05
 
3
 2
 1
 1
 2
 2
 2.17
 
4
 2
 2
 2
 1
 1
 2.11
 
5
 3
 1
 2
 1
 2
 2.19
 
6
 3
 2
 1
 2
 1
 2.31
 
7
 4
 1
 2
 2
 1
 2.21
 
8
 4
 2
 1
 1
 2
 2.25
 
K1
 4.03
 8.55
 8.71
 8.53
 8.61
  
 
K2
 4.28
 8.72
 8.56
 8.74
 8.66
 
K3
 4.50
  
  
  
  
 
K4
 4.46
  
  
  
  
 
k1
 2.02
 2.14
 2.18
 2.13
 2.15
 
k2
 2.14
 2.18
 2.14
 2.19
 2.17
 
k3
 2.25
  
  
  
  
 
k4
 2.23
  
  
  
  
 
R
 0.23
 0.04
 0.04
 0.06
 0.02
 
优方案
 A3
 B2
 C1
 D2
 E2
 
影响顺序
 A＞D＞B=C＞E
 

 

实验号
 A 碱浓度   CNaOH（%）
 B处理温度（℃）
 C固液比（W/V）
 D处理时间
（h）
 Ychitosan
（%）
 
1
 1
 1
 1
 1
 9.15
 
2
 1
 2
 2
 2
 10.01
 
3
 1
 3
 3
 3
 10.24
 
4
 2
 1
 2
 3
 12.01
 
5
 2
 2
 3
 1
 9.85
 
6
 2
 3
 1
 2
 10.79
 
7
 3
 1
 3
 2
 11.27
 
8
 3
 2
 1
 3
 12.56
 
9
 3
 3
 2
 1
 12.19
 
K1
 29.40
 32.43
 32.5
 31.19
  
 
K2
 32.65
 32.42
 34.21
 32.07
 
K3
 36.02
 33.22
 31.36
 34.81
 
k1
 9.80
 10.81
 10.83
 10.40
 
k2
 10.88
 10.81
 11.40
 10.69
 
k3
 12.01
 11.07
 10.45
 11.60
 
R
 2.21
 0.26
 0.95
 1.2
 
较优水平
 A3
 B3
 C2
 D3
 
影响主次
顺序
 A＞D＞C＞B
 

由表6可以看出，RA＞RD＞RB=RC＞RE。各因素对Y蛋白的影响按从大到小顺序依次为A（碱浓度）＞D（固液比）＞B（酸浓度）＝C（酸碱处理顺序）＞E（处理时间），最佳方案为：A3B2C1D2E2，即酸处理浓度3%，碱处理浓度15%，先酸后碱，固液比1∶15，处理时间为60min＋60min。从处理的效果看，酸碱交替法脱蛋白比单用酸或碱处理的效果要好的多，而且在此过程中不但去除了蛋白质，其他非甲壳素糖类、核酸、无机盐等杂质也进行了脱除。先酸后碱比先碱后酸处理溶出的蛋白质效果更好，可能是由于酸能够溶解膜中的脂类，从而有利于细胞破碎和胞内物质的外溢。
2. 4脱色工艺的研究细胞壁中含有大量的色素，为了进一步减少菌丝体中杂质含量、改善菌丝体色泽，有必要对菌丝体进行脱色处理。双氧水是一种经常使用的脱色剂，无毒，无害，无污染。利用双氧水的氧化性将色素氧化为无色物质，同时双氧水被还原成水。利用双氧水进行脱色后不需要加入其他还原剂，而且在对菌丝体进行过滤、洗涤时也不会产生废水。因此我们采用双氧水作为脱色剂进行脱色处理。经过实验确定最佳的双氧水用量为5%的1∶5倍40℃水浴30min。
2. 5脱乙酰基工艺的研究脱乙酰基一般是用强碱，我们实验中选择不同浓度的氢氧化钠。以壳聚糖得率Ychitosan（%）为考查指标，对影响因素碱浓度CNaOH、处理温度t、固液比W/V、处理时间τ作正交实验，以确定脱乙酰基的最佳工艺条件。采用L9（34）正交表，极差分析法分析实验结果。实验方案和结果如表7和表8所示。
表7 L9(34)正交实验因素水平表
Table7 Factors and level of orthogonal test L9(34)
  因素
 

水平
 A 碱浓度   CNaOH（%）
 B处理温度（℃）
 C固液比（W/V）  
 D处理时间
（h）
 
1
 40
 90
 1∶10
 1.5
 
2
 45
 100
 1∶15
 2.0
 
3
 50
 110
 1∶20
 2.5
 

 

 

 

 

表8 L9(34) 正交实验结果及极差分析表
Table8 Result and differential analysis of orthogonal test L9(34)
 

由表8可以看出，RA＞RD＞RC＞RB。各因素对Ychitosan的影响按从大到小顺序依次为A（碱浓度）＞D（处理时间）＞C（固液比）＞B（处理温度），最佳方案为：A3 B3 C2D3，即碱处理浓度50%，处理时间2.5h，固液比1∶15，温度110℃。以此工艺验证，所得壳聚糖得率为Ychitosan＝13.02%。
3．结论
   （1）酸碱交替法脱蛋白比单用酸或碱处理的效果要好的多，其较优的工艺条件为：先用3%的盐酸蒸馏处理1h，水洗至中性，然后用15%的氢氧化钠蒸馏处理1h，水洗至中性，固液比均为1∶15。脱蛋白效果良好。
（2）采用双氧水作为脱色剂进行脱色处理。经过实验确定最佳的双氧水用量为5%的1∶5倍40℃水浴30min。所得产品呈乳白色，该法无污染，且双氧水无毒无害，是一种很好的脱色剂。
（3）最佳的脱乙酰基工艺条件为：50%氢氧化钠处理2.5h，固液比1∶15，温度110℃。壳聚糖得率约为13%。测定所得壳聚糖产品性能指标，与壳聚糖标准比较，可以发现所得产品性能优良，达到食品级壳聚糖的要求。
参考文献：
[1] 徐良峰，杨建平，陈开勋.甲壳素的应用及研究进展[J].化学工业与工程技术，2003，124（5）：24-28.
[2] 张永刚，左秀锦.甲壳素、壳聚糖及其衍生物的研究进展[J].大连大学学报，2000，21（4）：52-55.
[3] 符·波·扎依采.海洋生物综合利用[M].北京：海洋出版社，1987.
[4] 汤亚杰，方庆华，胡炜炜等.甲壳质和壳聚糖的研究[J].冷饮与速冻食品工业，2000，（3）：7-11.
[5] 丁云桥，初春，李振娥.国内从丝状真菌中提取甲壳素/壳聚糖研究状况[J]. 山东化工，2002，31：8-10.
[6] 孙勇，李素兰.壳聚糖开发与应用研究进展[J].应用科技，2000，27（9）：34-36.
[7] 蒋挺大.壳聚糖[M].北京：化学工业出版社，2001.
新型涤棉织物的开发，纺织信息周刊，2004，（36）：23.
指导教师简介：
王传芬（1980-），山东武城县人，工学硕士，德州学院生物系助教，现从事发酵工程及生物下游技术方面的研究，在核心期刊发表论文近十篇。
作者简介：
李静（1986—）女，中共党员，2004级生物技术本科在读，山东潍坊人，在校期间多次获三好学生，优秀团员等荣誉称号，2006年被评为山东省优秀大学生。
孙绪华（1987－）女，团员，2005级生物科学本科在读，山东日照人，在校期间曾获优秀大学生、三好学生、优秀团员、省助学金、一等奖学金、二等奖学金等奖励。
徐丹（1986—）女，团员，2006级生物技术本科在读，山东泰安人，现任生物系学生会秘书长，在校期间曾获综合二等奖学金、优秀自愿者、三好学生等荣誉称号。